Produkty
Súprava Lifecosm na detekciu SARS-Cov-2-RT-PCR pre 2019-nCoV
Očakávané využitie
Táto súprava sa používa na kvalitatívnu detekciu nového koronavírusu (2019-nCoV) pomocou výterov z hrdla, výterov z nosohltana, bronchoalveolárnej lavážnej tekutiny a spúta. Výsledok detekcie pomocou tohto produktu slúži len na klinické účely a nemal by sa používať ako jediný dôkaz klinickej diagnózy a liečby. Odporúča sa komplexná analýza stavu v kombinácii s klinickými prejavmi pacienta a ďalšími laboratórnymi testami.
Princíp kontroly
Súprava je založená na jednokrokovej technológii RT-PCR. V skutočnosti boli ako cieľové oblasti amplifikácie vybrané gény ORF1ab a N nového koronavírusu (2019-nCoV) z roku 2019. Špecifické priméry a fluorescenčné sondy (sondy génu N sú označené FAM a sondy ORF1ab sú označené HEX) sú určené na detekciu RNA koronavírusu nového typu 2019 vo vzorkách. Súprava tiež obsahuje endogénny detekčný systém internej kontroly (sonda génu internej kontroly označená CY5) na monitorovanie procesu odberu vzoriek, amplifikácie RNA a PCR, čím sa znižuje počet falošne negatívnych výsledkov.
Hlavné komponenty
| Komponenty | Objem()48T/Súprava） |
| Reakčný roztok RT-PCR | 96 µl |
| nCOV primer TaqMan sondová zmes（ORF1ab,N gén, RNaseP gén） | 864 µl |
| Negatívna kontrola | 1500 µl |
| nCOV Pozitívna kontrola（l ORF1ab N Gen） | 1500 µl |
Vlastné činidlá: činidlá na extrakciu alebo purifikáciu RNA. Negatívna/pozitívna kontrola: Pozitívnou kontrolou je RNA obsahujúca cieľový fragment, zatiaľ čo negatívnou kontrolou je voda bez nukleových kyselín. Počas používania by sa mali podieľať na extrakcii a mali by sa považovať za infekčné. S nimi by sa malo zaobchádzať a mali by sa zlikvidovať v súlade s príslušnými predpismi.
Interným referenčným génom je ľudský gén RnaseP.
Podmienky skladovania a dátum spotreby
-20±5 ℃, nevystavujte opakovanému zmrazovaniu a rozmrazovaniu viac ako 5-krát, platné 6 mesiacov.
Použiteľný nástroj
S FAM / HEX / CY5 a inými viackanálovými fluorescenčnými PCR prístrojmi.
Požiadavky na vzorky
1. Použiteľné typy vzoriek: výtery z hrdla, výtery z nosohltana, tekutina z bronchoalveolárnej laváže, spútum.
2. Odber vzoriek (aseptická technika)
Výter z hltana: Utrite mandle a zadnú stenu hltana dvoma tampónmi súčasne a potom ponorte hlavicu tampónu do skúmavky obsahujúcej odberový roztok.
Spútum: Po hlbokom zakašliavaní pacienta sa vykašliavané spútum odoberie do skúmavky so skrutkovacím uzáverom, ktorá obsahuje roztok na odber vzoriek; tekutina z bronchoalveolárnej laváže: Odber vzoriek vykonávajú zdravotnícki pracovníci. 3. Skladovanie a preprava vzoriek
Vzorky na izoláciu vírusu a testovanie RNA by sa mali testovať čo najskôr. Vzorky, ktoré je možné zistiť do 24 hodín, sa môžu skladovať pri teplote 4 ℃; tie, ktoré nie je možné zistiť do 24 hodín
hodiny by sa mali skladovať pri teplote -70 ℃ alebo nižšej (ak nie sú skladovacie podmienky -70 ℃, mali by sa
dočasne uskladnené v chladničke pri teplote -20 ℃). Vzorky by sa mali počas prepravy vyhýbať opakovanému zmrazovaniu a rozmrazovaniu. Vzorky by sa mali odoslať do laboratória čo najskôr po odbere. Ak je potrebné vzorky prepravovať na dlhé vzdialenosti, odporúča sa skladovanie v suchom ľade.
Testovacie metódy
1 Spracovanie vzorky a extrakcia RNA (oblasť spracovania vzorky)
Na extrakciu RNA sa odporúča odobrať 200 μl tekutej vzorky. Súvisiace kroky extrakcie nájdete v pokynoch komerčných súprav na extrakciu RNA. Negatívna aj negatívna
Kontrolné vzorky v tejto súprave boli zapojené do extrakcie.
2 Príprava PCR činidiel (oblasť prípravy činidiel)
2.1 Všetky komponenty vyberte zo súpravy, rozmrazte ich a premiešajte pri izbovej teplote. Pred použitím ich niekoľko sekúnd centrifugujte pri 8 000 otáčkach za minútu; vypočítajte potrebné množstvo činidiel a reakčný systém pripravte podľa nasledujúcej tabuľky:
| Komponenty | N porcia (25 µl systém) |
| nCOV primer TaqMan probemix | 18 µl × N |
| Reakčný roztok RT-PCR | 2 µl × N |
| *N = počet testovaných vzoriek + 1 (negatívna kontrola) + 1 (nCOVpozitívna kontrola) | |
2.2 Po dôkladnom premiešaní zložiek krátko centrifugujte, aby všetka tekutina zo steny skúmavky klesla na dno skúmavky, a potom alikvotne rozdeľte 20 µl amplifikačného systému do PCR skúmavky.
3 Odber vzoriek (priestor na prípravu vzoriek)
Po extrakcii pridajte 5 μl negatívnej a pozitívnej kontroly. RNA testovanej vzorky sa pridá do reakčnej skúmavky PCR.
Skúmavku pevne uzavrite a pred prenesením do oblasti amplifikačnej detekcie ju niekoľko sekúnd centrifugujte pri 8 000 otáčkach za minútu.
4 PCR amplifikácia (amplifikovaná detekčná oblasť)
4.1 Vložte reakčnú skúmavku do vzorkovacej cely prístroja a nastavte parametre nasledovne:
| javisko | Cyklus číslo | Teplota(°C) | Čas | kolekciamiesto |
| Reverzný smertranskripcia | 1 | 42 | 10 minút | - |
| Preddenaturácian | 1 | 95 | 1 minúta | - |
| Cyklus | 45 | 95 | 15 s | - |
| 60 | 30. roky | zber údajov |
Výber detekčného kanála prístroja: Pre fluorescenčný signál vyberte kanál FAM, HEX a CY5. Pre referenčný fluorescenčný signál NONE (ŽIADNY) nevyberajte ROX.
5 Analýza výsledkov (Nastavenie nájdete v experimentálnych pokynoch každého prístroja)
Po reakcii uložte výsledky. Po analýze upravte počiatočnú hodnotu, koncovú hodnotu a prahovú hodnotu základnej línie podľa obrázka (používateľ môže upraviť podľa skutočnej situácie, počiatočnú hodnotu je možné nastaviť na 3 až 15, koncovú hodnotu je možné nastaviť na 5 až 20) v logaritmickom grafe. Na prahovej hodnote okna je prahová čiara v logaritmickej fáze a amplifikačná krivka negatívnej kontroly je priamka alebo pod prahovou čiarou.
6 Kvalitatívna kontrola (súčasťou testu je procedurálna kontrola) Negatívna kontrola: Žiadna zjavná amplifikačná krivka pre detekčné kanály FAM, HEX, CY5
Pozitívna kontrola COV: zreteľná amplifikačná krivka detekčných kanálov FAM a HEX, hodnota Ct ≤ 32, ale žiadna amplifikačná krivka kanála CY5;
Vyššie uvedené požiadavky musia byť splnené súčasne v tom istom experimente, inak je experiment neplatný a je potrebné ho zopakovať.
7 Stanovenie výsledkov.
7.1 Ak sa v kanáloch FAM a HEX testovanej vzorky nenachádza amplifikačná krivka alebo hodnota Ct > 40 a v kanáli CY5 sa nachádza amplifikačná krivka, možno usúdiť, že vo vzorke sa nenachádza RNA nového koronavírusu 2019 (2019-nCoV);
.2 Ak má testovaná vzorka zreteľné amplifikačné krivky v kanáloch FAM a HEX a hodnota Ct je ≤40, možno usúdiť, že vzorka je pozitívna na nový koronavírus z roku 2019 (2019-nCoV).
7.3 Ak má testovaná vzorka jasnú amplifikačnú krivku iba v jednom kanáli FAM alebo HEX a hodnota Ct je ≤40 a v druhom kanáli nie je žiadna amplifikačná krivka, výsledky je potrebné otestovať znova. Ak sú výsledky opakovaného testu konzistentné, vzorku možno považovať za pozitívnu na nový test.
koronavírus 2019 (2019-nCoV). Ak je výsledok opakovaného testu negatívny, možno usúdiť, že vzorka je negatívna na nový koronavírus 2019 (2019-nCoV).
Pozitívna hodnota úsudku
Na určenie referenčnej hodnoty CT súpravy sa používa metóda ROC krivky a referenčná hodnota internej kontroly je 40.
Interpretácia výsledkov testov
1. Každý experiment by mal byť testovaný na negatívne a pozitívne kontroly. Výsledky testov je možné určiť iba vtedy, keď kontroly spĺňajú požiadavky na kontrolu kvality.
2. Keď sú detekčné kanály FAM a HEX pozitívne, výsledok z kanála CY5 (kanál internej kontroly) môže byť negatívny kvôli konkurencii systému.
3. Ak je výsledok internej kontroly negatívny a detekčné kanály FAM a HEX v skúmavke sú tiež negatívne, znamená to, že systém je deaktivovaný alebo je operácia nesprávna, test je neplatný. Preto je potrebné vzorky otestovať znova.
