Produkty
Lifecosm SARS-Cov-2-RT-PCR detekčná súprava pre 2019-nCoV
Očakávané použitie
Táto súprava sa používa na kvalitatívnu detekciu nového koronavírusu (2019-nCoV) pomocou výterov z hrdla, nazofaryngeálnych výterov, tekutiny z bronchoalveolárnej laváže, spúta. Výsledok detekcie tohto produktu je len pre klinickú referenciu a nemal by sa používať ako jediný dôkazy pre klinickú diagnózu a liečbu. Odporúča sa komplexná analýza stavu v kombinácii s klinickými prejavmi pacienta a inými laboratórnymi testami.
Princíp inšpekcie
Súprava je založená na jednokrokovej technológii RT-PCR.V skutočnosti boli gény ORF1ab a N nového koronavírusu (2019-nCoV) z roku 2019 vybrané ako cieľové oblasti amplifikácie.Špecifické priméry a fluorescenčné sondy (sondy génu N sú označené pomocou FAM a sondy ORF1ab sú označené pomocou HEX) sú navrhnuté tak, aby vo vzorkách detekovali 2019 nového typu koronavírusu.Súprava tiež obsahuje endogénny detekčný systém vnútornej kontroly (interná kontrolná génová sonda označená CY5) na monitorovanie procesu odberu vzorky, RNA a PCR amplifikácie, čím sa zníži počet falošne negatívnych výsledkov.
Hlavné komponenty
| Komponenty | Objem(48T/súprava) |
| RT-PCR reakčný roztok | 96 ul |
| nCOV primer TaqMan probemix (ORF1ab, N gén, RnaseP gén) | 864 ul |
| Negatívna kontrola | 1500 ul |
| nCOV Pozitívna kontrola（l ORF1ab N Gen） | 1500 ul |
Vlastné činidlá: RNA extrakčné alebo purifikačné činidlá.Negatívna/pozitívna kontrola: Pozitívna kontrola je RNA obsahujúca cieľový fragment, zatiaľ čo negatívna kontrola je voda bez nukleových kyselín.Počas používania by sa mali podieľať na extrakcii a mali by sa považovať za infekčné.Malo by sa s nimi zaobchádzať a likvidovať ich v súlade s príslušnými predpismi.
Vnútorným referenčným génom je ľudský gén RnaseP.
Podmienky skladovania a dátum exspirácie
-20±5 ℃, vyhnite sa opakovanému zmrazovaniu a rozmrazovaniu viac ako 5-krát, platí 6 mesiacov.
Použiteľný nástroj
S FAM / HEX / CY5 a iným viackanálovým fluorescenčným PCR prístrojom.
Vzorové požiadavky
1. Použiteľné typy vzoriek: výtery z hrdla, výtery z nosohltanu, tekutina z bronchoalveolárnej laváže, spútum.
2. Odber vzoriek (aseptická technika)
Faryngeálny tampón: Utrite mandle a zadnú stenu hltana dvoma tampónmi súčasne a potom ponorte hlavu tampónu do skúmavky obsahujúcej roztok na odber vzoriek
Spútum: Keď má pacient hlboký kašeľ, zachyťte vykašľaný spút do skúmavky so skrutkovacím uzáverom, ktorá obsahuje roztok na odber vzoriek;tekutina z bronchoalveolárnej laváže：Odber vzoriek zdravotníckymi pracovníkmi.3.Skladovanie a preprava vzoriek
Vzorky na izoláciu vírusu a testovanie RNA by sa mali testovať čo najskôr.Vzorky, ktoré je možné detegovať do 24 hodín, možno skladovať pri 4 °C;tie, ktoré sa nedajú zistiť do 24
hodiny by sa mali skladovať pri teplote -70 ℃ alebo nižšej (ak nie sú podmienky skladovania -70 ℃, mali by byť
dočasne uskladnené pri teplote -20 °C v chladničke).Počas prepravy by sa vzorky mali vyhýbať opakovanému zmrazovaniu a rozmrazovaniu.Vzorky by mali byť zaslané do laboratória čo najskôr po odbere.Ak je potrebné vzorky prepravovať na veľké vzdialenosti, odporúča sa skladovanie suchým ľadom.
Testovacie metódy
1 Spracovanie vzoriek a extrakcia RNA (oblasť spracovania vzoriek)
Na extrakciu RNA sa odporúča odobrať 200 μl tekutej vzorky.Súvisiace kroky extrakcie nájdete v pokynoch komerčných súprav na extrakciu RNA.Aj negatívne, aj negatívne
kontroly v tejto súprave sa podieľali na extrakcii.
2 Príprava činidla pre PCR (oblasť na prípravu činidla)
2.1 Odstráňte všetky komponenty zo súpravy a rozmrazte a premiešajte pri izbovej teplote.Pred použitím niekoľko sekúnd odstreďte pri 8 000 otáčkach za minútu;vypočítajte požadované množstvo činidiel a reakčný systém sa pripraví tak, ako je uvedené v nasledujúcej tabuľke:
| Komponenty | N porcia (25 µl systém) |
| nCOV primer TaqMan probemix | 18 ul x N |
| RT-PCR reakčný roztok | 2 ul x N |
| *N = počet testovaných vzoriek + 1 (negatívna kontrola) + 1 (nCOVpozitívna kontrola) | |
2.2 Po dôkladnom premiešaní komponentov krátko centrifugujte, aby všetka tekutina na stene skúmavky padla na dno skúmavky, a potom alikvotujte 20 µl amplifikačného systému do skúmavky PCR.
3 Odber vzoriek (oblasť prípravy vzoriek)
Po extrakcii pridajte 5 μl negatívnych a pozitívnych kontrol.RNA vzorky, ktorá sa má testovať, sa pridá do skúmavky PCR.
Skúmavku pevne uzavrite a centrifugujte pri 8 000 otáčkach za minútu niekoľko sekúnd pred jej prenesením do oblasti detekcie amplifikácie.
4 PCR amplifikácia (amplifikovaná oblasť detekcie)
4.1 Umiestnite reakčnú skúmavku do vzorkovej kyvety prístroja a nastavte parametre nasledovne:
| etapa | Cyklus číslo | Teplota(°C) | Čas | zberstránky |
| Obrátenéprepis | 1 | 42 | 10 min | - |
| Preddenaturácian | 1 | 95 | 1 minúta | - |
| Cyklus | 45 | 95 | 15s | - |
| 60 | 30-te roky | zber dát |
Výber kanálu detekcie prístroja: Vyberte kanál FAM、HEX、CY5 pre fluorescenčný signál.Pre referenčné fluorescenčné NONE, prosím, nevyberajte ROX.
5 Analýza výsledkov (Nastavenie nájdete v experimentálnych pokynoch každého nástroja)
Po reakcii uložte výsledky.Po analýze upravte počiatočnú hodnotu, koncovú hodnotu a prahovú hodnotu základnej línie podľa obrázka (používateľ môže upraviť podľa skutočnej situácie, počiatočnú hodnotu je možné nastaviť na 3~15, koncovú hodnotu možno nastaviť na 5~20, úprava) v logaritmickom grafe Na prahu okna je prahová čiara v logaritmickej fáze a amplifikačná krivka negatívnej kontroly je priamka alebo pod prahovou čiarou).
6 Kvalitná kontrola（Procedurálna kontrola je zahrnutá v teste） Negatívna kontrola: Žiadna zjavná krivka amplifikácie pre detekčné kanály FAM, HEX, CY5n
COV pozitívna kontrola: zjavná amplifikačná krivka FAM a HEX detekčných kanálov, Ct hodnota ≤ 32, ale žiadna amplifikačná krivka CY5 kanála;
Vyššie uvedené požiadavky musia byť splnené súčasne v tom istom experimente;v opačnom prípade je experiment neplatný a je potrebné ho zopakovať.
7 Stanovenie výsledkov.
7.1 Ak v kanáloch FAM a HEX testovanej vzorky nie je žiadna krivka amplifikácie alebo hodnota Ct > 40 a v kanáli CY5 je krivka amplifikácie, možno usúdiť, že v roku 2019 neexistuje nový koronavírus (2019-nCoV) RNA vo vzorke;
.2 Ak má testovaná vzorka zjavné amplifikačné krivky v kanáloch FAM a HEX a hodnota Ct je ≤40, možno usúdiť, že vzorka je pozitívna na nový koronavírus z roku 2019 (2019-nCoV).
7.3 Ak má testovaná vzorka jasnú amplifikačnú krivku iba v jednom kanáli FAM alebo HEX a hodnota Ct je ≤ 40 a v druhom kanáli nie je žiadna amplifikačná krivka, výsledky je potrebné znova otestovať.Ak sú výsledky opakovaného testu konzistentné, vzorka môže byť vyhodnotená ako pozitívna pre nový
koronavírus 2019 (2019-nCoV).Ak je výsledok opätovného testu negatívny, možno usúdiť, že vzorka je negatívna na nový koronavírus z roku 2019 (2019-nCoV).
Hodnota pozitívneho úsudku
Metóda ROC krivky sa používa na určenie referenčnej hodnoty CT súpravy a referenčná hodnota internej kontroly je 40.
Interpretácia výsledkov testov
1. Každý experiment by mal byť testovaný na negatívne a pozitívne kontroly.Výsledky testov možno určiť len vtedy, keď kontroly spĺňajú požiadavky na kontrolu kvality
2. Keď sú kanály detekcie FAM a HEX pozitívne, výsledok z kanála CY5 (interný kontrolný kanál) môže byť negatívny v dôsledku systémovej konkurencie.
3. Ak je výsledok internej kontroly negatívny, ak sú negatívne aj detekčné kanály FAM a HEX skúmavky, znamená to, že systém je deaktivovaný alebo operácia je nesprávna, test je neplatný.Preto je potrebné vzorky znova otestovať.
